• par ponction veineuse sur tube à hémogramme (EDTA ou héparine), ce qui permet de pratiquer sur le même prélèvement les examens hématologiques.
• par piqûre à l'aide d'une microlance au bout du doigt.

Réaliser l'étalement

• idéalement à l'aide d'une lame rodée, à nettoyer soigneusement après chaque usage, avec de l'alcool et une compresse.
• à défaut, à l'aide d'une lamelle (à détruire après usage).

Le frottis doit être mince, régulier et comporter une tête, un corps, une queue et deux bords. Pour cela, l'étalement doit se faire d'un mouvement régulier, ni trop lent (frottis trop mince débordant à l'autre extrêmité de la lame), ni trop rapide (frottis court et épais).

Une fois réalisé, le frottis doit être séché immédiatement, manuellement par agitation, ou à l'aide d'un ventilateur. Il doit être identifié avec précision (nom, date)à l'aide d'un crayon à papier, en écrivant sur la tête du frottis, après séchage complet de ce dernier.

Le stockage se fera à l'abri des mouches. Si un stockage prolongé, supérieur à 6 heures, est prévisible, il faut fixer le frottis au méthanol (bain de 3 minutes ou évaporation d'un film couvrant le frottis). Il ne faut JAMAIS fixer par flambage de type bactériologique.

2. COLORATION DU FROTTIS

1. Le prélèvement doit être effectué au bout du doigt car un prélèvement sur anticoagulant (EDTA) rend plus difficile la confection de la goutte épaisse.
2. Avant de colorer une goutte épaisse, il faut soit la laisser sécher 24 heures à la température ambiante, soit, à la rigueur, au moins deux heures à 37°C. Cette donnée est peu compatible avec un examen en urgence. Des artifices techniques permettent un séchage accéléré, mais ils induisent des contraintes matérielles (séchage au four à micro-ondes).
3. Les inconvénients majeurs apparaissent au moment de la lecture : en effet, la morphologie des parasites est modifiée et les hématies parasitées, dont la morphologie est très utile au diagnostic d'espèce, sont lysées. En outre, la numération des hématies parasitées n'est pas non plus réalisable. Seule est envisageable une évaluation très grossière de la parasitémie faisant appel à un rapport parasites/leucocytes.

Ainsi, la goutte épaisse apparaît comme une technique d'enrichissement anciennement anciennement connue, qui n'est fiable et sensible que lue par des techniciens par des techniciens très entraînés, mais qui, même dans des mains expertes, n'est pas utilisable dans le cadre de l'urgence et ne permet pas de répondre rapidement aux trois questions posées au biologiste : l'examen met-il en évidence un Plasmodium ? S'agit-il de Plasmodium falciparum ? S'il s'agit de Plasmodium falciparum, quelle est la densité parasitaire ?

il sera peut-être nécessaire de préconiser à nouveau une utilisation large de cette méthode si la disparition annoncée du QBC Malaria Test® est effective, avant que ne soient développées d'autres techniques au seuil de détection bas.

• la centrifugation, qui sépare les éléments en fonction de leur densité, concentre et range les éléments identiques à certains niveaux prévisibles du tube.
• pendant la centrifugation, un flotteur vient se positionner à cheval sur le manteau leuco-plaquettaire et la couche érythrocytaire : il provoque une expansion mécanique des cellules qui l'entourent, dans l'espace résiduel de 40 µm, au contact de la paroi du tube où elles seront facilement observables.
• l'acridine orange, agent intercalant spécifique des acides nucléiques, après excitation par une source lumineuse appropriée (UV ou filtrée par dichroïsme), induit chez les cellules possédant du matériel nucléique une coloration métachromatique différentielle entre l'ADN (vert pomme à jaune vert) et l'ARN (vert à rouge orangé). Elle va révéler la présence des parasites sur le fond sombre des hématies a priori dépourvues de structures nucléiques systématisées.

Matériel

1. La trousse est composée de différents éléments :

• un tube capillaire à micro-hématocrite, en verre, de 75 mm de long. Sur les parois internes du tube sont fixés divers réactifs : acridine orange à une extrêmité ; anticoagulant (héparinate de sodium, EDTA) à l'extrêmité opposée ; oxalate de potassium destiné à accroître la densité de globules rouges par action osmotique, facilitant ainsi leur séparation d'avec les globules blancs (notamment entre les réticulocytes et les granulocytes).
• un flotteur cylindrique en plastique, de même gravité relative que celle des leucocytes, mesurant 20 mm de long.
• un bouchon obturateur en plastique.

2. La mise en oeuvre nécessite le matériel suivant :

• une centrifugeuse à micro-hématocrite dont le plateau est équipé de 20 logettes adaptées à la dimension des tubes,
• un support plastifié, le "paraviewer", comportant une gouttière destinée à recevoir le tube et permettant l'examen sur la platine du microscope,
• un microscope équipé d'une source de lumière UV et de filtres FITC, d'un objectif à immersion au grossissement X60 ou X50 et d'une distance focale ³ 0,34 mm pour s'affranchir de l'épaisseur de la paroi du tube et pour pouvoir examiner plusieurs épaisseurs cellulaires.Il existe un modèle de terrain, d'un principe original, pouvant fonctionner en mode secteur ou sur batterie : il est adaptable sur tout microscope standard ; il comporte une source de lumière froide reliée par fibre optique à un objectif à immersion X60, modifié par l'adjonction de filtres dichroïques placés sur le trajet de la lumière, qui permettent l'excitation de l'acridine orange et l'obtention d'une image fluorescente.

Méthode

1. Le prélèvement :

L'échantillon de sang nécessaire, soit 55 à 65 µl, est obtenu par capillarité à partir de sang veineux prélevé sur anticoagulant ou de sang capillaire après piqûre d'un doigt. Le remplissage s'opère au niveau de l'extrêmité "coatée" en anticoagulants, le niveau de remplissage étant repéré par deux marques inscrites sur le tube.

2. La préparation :

Le tube, pris entre deux doigts gantés, est alternativement incliné d'un côté et de l'autre afin de permettre le contact des éléments figurés du sang avec l'acridine orange. Un bouchon obturateur est ensuite placé à l'extrêmité opposée à celle du remplissage, puis le flotteur est introduit à l'aide d'une pince pour éviter le contact avec les doigts. Le délai d'attente avant la centrifugation peut, dans notre expérience, atteindre 5 heures sans altération de la lisibilité. Le tube ainsi conditionné est déposé dans la centrifugeuse où il subit une accélération de 12 000 g pendant 5 minutes.

3. La lecture :

La lecture est possible immédiatement. Elle permet de visualiser successivement sous le plasma le manteau plaquettaire, l'anneau lympho-monocytaire, la couche des granuleux et enfin le sédiment érythrocytaire.

Notre pratique nous montre que le protocole classique (examen en lumière UV de la couche érythrocytaire depuis l'interface globules rouges/globules blancs, sur quelques champs en dessous) peut être pris en défaut dans certaines situations, en particulier chez les patients porteurs de gamétocytes de Plasmodium falciparum et/ou de formes asexuées de Plasmodium vivax, Plasmodium ovale ou Plasmodium malariae.

2. CONDUITE PRATIQUE ET CRITERES D'IDENTIFICATION

La conduite pratique :

Il est préférable de prélever un échantillon de sang, capillaire ou veineux, légèrement supérieur à celui préconisé par le fabricant. Le tube est rempli jusqu'au milieu, ce qui correspond à une centaine de microlitres. Dans ces conditions, il n'y a pas de répercussions péjoratives sur la qualité de la coloration par l'acridine ni sur la séparation des différentes couches lors de la centrifugation. Puis le tube est examiné en fluorescence, au grossissement X50, la mise au point initiale centrée sur la couche érythrocytaire au niveau de l'interface avec les leucocytes. Le diagnostic positif est souvent posé instantanément. En cas de négativité, toute la hauteur du sédiment cellulaire est parcourue en explorant, pour chaque champ, les quatre principaux plans de netteté accessibles par le jeu de la vis micrométrique.

Il est indispensable de rajouter à ce protocole classique une étape fondamentale qui consiste en l'examen du "buffy coat" sous lumière blache, i.e. sans fluorescence. Cette étape permet très facilement d'objectiver, grâce à leur pigment clairement discernable, les stades sexués des différentes espèces, qui migrent de façon préférentielle dans les couches leucocytaires et peuvent ne pas être représentés dans le sédiment érythrocytaire, notamment en cas de faible parasitémie. Cette procédure permet également le repérage des éventuels leucocytes mélanifères, parfois seuls stigmates d'un contact récent avec le parasite.

Le diagnostic positif :

La morphologie des parasites reste très comparable à celle observée sur frottis sanguin mince, même en cours de traitement. Sur un fond sombre, où les membranes érythrocytaires dessinent une résille, les trophozoïtes s'observent en position intra-érythrocytaire. Le noyau émet une fluorescence verte intense, homogène, de 1 à 2 µm de diamètre. Le cytoplasme, de taille variable, émet une fluorescence de vert à orange, moins intense, à bords nets, en croissant, de largeur et d'épaisseur variables. Il enserre le noyau entre ses extrêmités et délimite une zone non fluorescente correspondant à la vacuole nutritive.

Le diagnostic positif de trophozoïte repose donc TOUJOURS sur une image associant un noyau et un cytoplasme, en situation intra-érythrocytaire, comme on peut le vérifier en variant les plans de netteté.

En cas d'hémolyse des hématies, la situation intra-érythrocytaire disparaît, mais la morphologie du parasite est conservée.

Le diagnostic différentiel :

- La distinction des parasites et des leucocytes est très facile. La taille des éléments, comparée à celle des globules rouges, est discriminante : le noyau du parasite fait environ 2 µm, celui des leucocytes 5 fois plus ; sa forme est compacte chez le trophozoïte, lobulée chez le polynucléaire.

- Ces critères permettent d'éliminer facilement les débris cellulaires contaminant éventuellement la couche des hématies car ils ne forment pas une image systématisée compatible avec le diagnostic et leur fluorescence rougeâtre s'éteint en quelques secondes sous excitation lumineuse, contrairement à celle des parasites.

- De même, les corps de Jolly se présentent sous la forme d'un point très brillant, vert pomme, parfaitement circulaire, souvent centré par un petit point sombre non fluorescent. Parfois, ils sont entourés d'un lambeau rougeâtre pouvant évoquer un cytoplasme, mais cette fluorescence s'éteint aussi très rapidement.

- Les plaquettes peuvent poser un délicat problème car elles contaminent fréquemment la couche des hématies. En effet, leur taille est proche de celle d'un trophozoïte et, comme sur les frottis sanguins, elles se superposent volontiers aux hématies. Cependant, on ne retrouve pas de morphologie associant noyau et cytoplasme, mais plutôt un aspect hétérogène et micro-granulaire de la fluorescence, de tonalité vert pâle parsemée de ponctuations jaunâtres, aux limites incertaines. L'examen aux différents niveaux de netteté.

- Le seul vrai problème de diagnostic différentiel, qui pourrait exceptionnellement se poser, est constitué par la distinction entre Plasmodium et Babesia du fait de la similitude d'aspect, de taille et de situation intracellulaire. Toutefois, il nous a été possible de retrouver dans le cas de la babésiose, par le jeu de la vis micrométrique, un aspect en marguerite que nous n'avons jamais observé en cas de paludisme.

L'habitude vient rapidement au lecteur, mais, en cas de doute, il faut considérer qu'UN ASPECT ATYPIQUE DOIT ETRE RENDU NEGATIF. Le cas limite théorique est représenté par une parasitémie extrêmement faible, une morphologie très altérée par un traitement antérieur à l'examen et la présence de plaquettes de morphologie anormale, comme il est possible d'en rencontrer dans le paludisme.

Orientation du diagnostic d'espèce :

Le diagnostic d'espèce repose sur un faisceau d'arguments. Dispersion et monomorphisme de l'image constituent un très bon argument en faveur d'une infection par Plasmodium falciparum. Polymorphisme et concentration permettent d'évoquer une autre espèce. Cependant, il s'agit là de conditions idéales, rarement réalisées (faible parasitémie, morphologie altérée par une prise médicamenteuse, présence de deux espèces). L'examen du frottis mince coloré par le MGG reste indispensable au diagnostic d'espèce. Il est nécessaire également à l'évaluation de la densité parasitaire.

Lecture en fluorescence : étude des couches leucocytaires et des érythrocytes

Lecture en lumière blanche : étude des couches leucocytaires

3. PERFORMANCES DU TEST

Les performances du test nous paraissent étroitement dépendantes de la formation du lecteur, de l'utilisation d'un matériel adéquat, tout particulièrement l'objectif, et d'un protocole de lecture complet.

Sensibilité, spécificité :

Les résultats montrent une supériorité du test face aux méthodes classiques. Le seuil de détection du test, évalué sur une cascade de dilutions d'une culture de Plasmodium falciparum bloquée au stade de trophozoïtes jeunes, est estimé à 0,1 à 1 hématie parasitée par microlitre (HPM).

Des études ont montré que le test dépiste une parasitémie plus précocément que la goutte épaisse. De même, la clairance parasitaire est plus élevée avec ce test (84 ± 13 heures) qu'avec le frottis (66 ± 11 heures). Comparé aux tests de biologie moléculaire (sondes nucléiques) et de cytométrie de flux, le QBC reste le plus performant. C'est donc actuellement la méthode de diagnostic la plus sensible.

En appliquant les critères de diagnostic positif du genre Plasmodium, les résultats montrent une spécificité de 100 %.

Faisabilité :

L'aspect le plus remarquable du test est sa rapidité de réponse, même en cas de parasitémie très faible : la lecture est possible 6 minutes après le prélèvement et si en moyenne un diagnostic positif est posé en moins d'une minute, trois minutes suffisent pour rendre un test négatif aux limites du seuil de détection.

La sécurité et la simplicité de la mise en oeuvre sont des qualités éprouvées et approuvées par l'ensemble des utilisateurs. La qualité du marquage des parasites par l'acridine orange est constante. Grâce au caractère très discriminant de l'image du parasite à l'état frais, l'apprentissage de la lecture avec la reconnaissance formelle des parasites demande moins de 2 heures à un technicien déjà formé au diagnostic parasitologique.

Conservé à l'obscurité à + 4 °C, un tube centrifugé reste lisible 10 à 15 jours. Ce délai tombe à 48 heures en cas de conservation à + 37 °C. La réalisation d'un frottis en parallèle permet l'archivage des échantillons positifs.

4. CONCLUSION

Malgré ses limites, le QBC-malaria test® constitue la seule véritable alternative aux méthodes de référence que sont le frottis et la goutte épaisse. Il apporte un progrès manifeste en termes de sensibilité, de rapidité et de fiabilité. Il est tout à fait adapté au diagnostic et en particulier à celui des nouvelles formes cliniques pauci-parasitémiques du paludisme.

Son intérêt a été prouvé dans les enquêtes épidémiologiques et il est maintenant difficile de s'en priver dans ce cadre précis.

Il est extrêmement regrettable que, sur des arguments purement économiques, le fabricant ait choisi de ne plus commercialiser le matériel. Les réactifs sont encore disponibles.

• réalisation aisée par un personnel non formé aux techniques parasitologiques
• interprétation incontestable dans l'immense majorité des cas
• test spécifique de Plasmodium falciparum, avec les implications thérapeutiques et opérationnelles que peut entraîner un résultat positif
• faisabilité sur le terrain.

Ils ne doivent pas être utilisés seuls, sauf conditions d'isolement, car ils n'apportent pas tous les éléments nécessaires à une prise en charge thérapeutique optimale des accès fébriles en zone d'endémie palustre :

• spécificité de Plasmodium falciparum (des tests "multi-espèces" existent, mais ne sont pas encore commercialisés en France)
• détection des formes trophozoïtaires seules
• absence de corrélation entre l'intensité du signal et la densité parasitaire.

• giemsa dilué au 1/10 pendant 10 minutes
• giemsa dilué au 1/20 pendant 20 minutes : meilleur contraste

- Laver à l'eau tamponnée.

- Essuyer la lame du côté opposé au frottis.

- Sécher : étuve, séchoir à cheveux, ventilateur.

ATTENTION

LE MAY-GRUNWALD S'EVENTE CAR IL CONTIENT DE L'ALCOOL

IL FAUT SYSTEMATIQUEMENT PRATIQUER UNE FIXATION EN PREALABLE A LA COLORATION

2. LA COLORATION DE GIEMSA

- Fixer au méthanol.

- Couvrir la lame avec une dilution de Giemsa au 1/20 préparée extemporanément à l'aide d'une eau tamponnée. Laisser agir 20 à 30 minutes (c'est l'expérience qui permet de déterminer une durée optimale).

- Laver à l'eau tamponnée.

- Essuyer la lame du côté opposé au frottis.

- Sécher : étuve, séchoir à cheveux, ventilateur.

3. LA COLORATION RAPIDE (PANOPTIQUE)

- Couvrir la lame à l'aide de 10 gouttes de colorant panoptique et laisser agir 90 secondes.

- Ajouter la même quantité d'adjuvant pour hématologie et laisser agir 90 secondes.

- Rincer avec ce même adjuvant.

- Essuyer la lame du côté opposé au frottis.

- Sécher la lame immédiatement, en faisant attention car le frottis est fragile.

• artéfacts de séchage ou de coloration
• corps étrangers
• projection d'une plaquette sanguine sur une hématie

RECONNAITRE LE STADE EVOLUTIF

1. Plasmodium falciparum : parasitisme souvent intense et monotone, avec des parasites au même stade évolutif, celui de trophozoïte (pluie d'anneaux). Le polyparasitisme de l'hématie est fréquent.
2. Plasmodium vivax : parasitisme peu dense avec bigarrure (mélange des différents stades évolutifs). Le polyparasitisme est exceptionnel.
3. Plasmodium malariae : parasitisme peu dense avec bigarrure et abondance du pigment palustre.
4. Plasmodium ovale : parasitisme peu dense, bigarrure et possibilité de polyparasitisme.

1. Plasmodium falciparum : taille et forme non modifiée. Les tâches de Maurer, classiques, sont souvent mal mises en évidence par la coloration. Ce sont des tâches de taille irrégulière, peu nombreuses, de couleur brun-rouge. On les compare à des éraillures en coup d'ongle.
2. Plasmodium vivax : l'hématie est augmentée de volume et apparaît pâle (deshémoglobinisée). elle est parfois déformée. Au stade de trophozoïte âgé et de schizonte, on observe un semis de granulations rondes, de petite taille, très nombreuses, colorées en brun rouge : les granulations de Schüffner.
3. Plasmodium malariae : l'hématie est diminuée de volume, sans modification de forme. Elle est de coloration plus sombre. Le pointillé de Zieman est très inconstant.
4. Plasmodium ovale : l'hématie est modérément augmentée de taille. Elle est souvent ovalisée avec une extrémité frangée. Elle est parfois de teinte pâle, mais surtout il existe des granulations de Schüffner dès le stade de trophozoïte jeune.

1. Plasmodium falciparum :

Le trophozoïte jeune est petit (1/4 de la taille de l'hématie). Il est souvent accolé à la paroi de l'hématie et prend l'aspect de bracelet arabe (noyau bilobé et cytoplasme fin). Il n'y a pas de pigment palustre.

Le trophozoïte âgé est plus volumineux et plus irrégulier (forme de raquette, de filet à papillons).

Le schizonte et la rosace ne sont généralement pas rencontrés dans le sang périphérique en dehors des accès de neuropaludisme à forte parasitémie.

Le gamétocyte mature est caractéristique : sa forme en cigare, en banane, déforme l'hématie dont on ne distingue la présence que difficilement. Sa taille est de 8 à 15 microns.

 

Plasmodium falciparum (d'après G. Villain)

2. Plasmodium vivax :

Le trophozoïte jeune occupe le 1/3 de l'hématie. Le cytoplasme est plus épais que celui de Plasmodium falciparum. Il n'y a pas de pigment palustre.

Le trophozoïte âgé est caractéristique (corps amoeboïde). Le cytoplasme est étiré en tous sens, déformé, très polymorphe. La vacuole nutritive est mal délimitée et le pigment palustre fin.

Le schizonte comporte des noyaux irréguliers en taille et en répartition dans le parasite.

La rosace est volumineuse : elle occupe toute l'hématie et comporte 12 à 18 mérozoïtes irrégulièrement répartis. Le pigment est rassemblé au centre.

Le gamétocyte est arrondi ou ovalaire et occupe la quasi totalité de l'hématie. Le noyau est excentré et le pigment abondant.

Plasmodium vivax (d'après G. Villain)

 

3. Plasmodium malariae :

Le trophozoïte jeune est comparable en taille et en forme à celui de Plasmodium vivax, mais à ce stade il possède un grain de pigment.

Le trophozoïte âgé est plus volumineux. Le pigment est très abondant. On retrouve deux aspects classiques : la bande équatoriale, forme rigide et transversale du parasite dans l'hématie, et la forme hémogrégariniforme où le parasite se replie en vermicule, avec un pigment abondant.

Le schizonte ne se différencie du trophozoïte âgé que par la division du noyau.

La rosace est caractéristique par son aspect régulier en marguerite, avec au centre un pigment palustre très abondant et en périphérie 8 à 12 mérozoïtes régulièrement répartis.

Le gamétocyte est globuleux et possède un abondant pigment palustre. Il occupe la presque totalité de l'hématie.

Plasmodium malariae (d'après G. Villain)

4. Plasmodium ovale :

Le trophozoïte jeune est comparable à celui de Plasmodium vivax, mais il possède souvent un fin grain de pigment.

Le trophozoïte âgé possède du pigment. Le parasite grossit et se déforme. A ce stade, le cytoplasme peut posséder une partie filamenteuse, mais il ne forme jamais de corps amoeboïde.

Le schizonte ne se différencie du trophozoïta âgé que par la division du noyau.

La rosace comporte 8 mérozoïtes, parfois plus, répartis plus ou moins régulièrement. Le pigment est dense, mais plus fin que chez Plasmodium malariae.

Le gamétocyte ressemble à celui de Plasmodium vivax, mais il n'occupe pas toute l'hématie.

Plasmodium ovale (d'après G. Villain)

CRITERES MAJEURS DE DIAGNOSTIC D'ESPECE

Plasmodium falciparum :

• aspect monotone du frottis avec pluriparasitisme
• densité parasitaire parfois très élevée
• hématies parasitées non déformées
• parasites souvent jeunes et de petite taille
• absence de rosaces
• gamétocytes en banane

Plasmodium vivax :

• frottis bigarré
• hématies parasitées augmentées de volume et deshémoglobinisées
• présence de granulation de Schüffner au stade de trophozoïte
• rosace irrégulière à 12 à 18 mérozoïtes
• gamétocyte occupant la totalité de l'hématie
• corps amoeboïdes

Plasmodium malariae :

• frottis bigarré
• hématies parasitées diminuées de taille
• pigment palustre très abondant
• trophozoïte en bande équatoriale
• rosace très régulière à 8 à 12 mérozoïtes
• gamétocyte occupant la totalité de l'hématie

Plasmodium ovale :

• frottis bigarré avec polyparasitisme fréquent
• hématies parasitées ovalisées avec extrémité frangée
• granulations de Schüffner dès le stade de trophozoïte jeune
• rosace irrégulière à 8 mérozoïtes, parfois plus
• gamétocyte n'occupant pas la totalité de l'hématie

ATTENTION

En dehors de la découverte d'un élément de morphologie pathognomonique (gamétocytes de Plasmodium falciparum, corps amoeboïde de Plasmodium vivax, bande équatoriale de Plasmodium malariae), l'identification de l'espèce plasmodiale ne peut que se faire sur un faisceau d'arguments concordants.